Mario a un frère, Luigi, qui lui ressemble physiquement. Il est cependant plus grand, plus timide, un peu moins courageux mais il est plus léger et saute plus haut. Il porte des vêtements verts. Certains jeux Nintendo lui sont dédiés.

Mario et la Princesse Peach sont parfois accompagnés de Toad, le champignon qui apparaît en 1988 dans Super Mario Bros 2, et qui est généralement considéré comme le valet de la Princesse (cf. Super Mario Bros 3).

Mario possède aussi une monture, Yoshi, un animal qui a une forme proche d'un dinosaure. Il apparaît pour la première fois dans Super Mario World.

Wario est le double maléfique de Mario. On présume qu'il est son cousin jaloux.

Luigi a également son double maléfique, Waluigi, qui porte des vêtements de couleur violette et qui joue aussi un rôle important, notamment dans Mario Power Tennis sur GameCube.

Mario est amoureux de la Princesse Peach (qui a elle-même une amie du nom de Daisy). Peach a une robe rose et des cheveux blonds, Daisy une robe orange et des cheveux châtains.

Dans certaines aventures, comme dans Mario & Luigi : les Frères du Temps et Yoshi's Island (SNES), Mario apparaît sous la forme de Bébé Mario. Bébé Mario est Mario plus jeune, d'après Les Frères du Temps.

Le pire ennemi de Mario reste Bowser, le roi des Koopas, dont il fait échouer les plans diaboliques depuis sa naissance.

Les Koopas sont des tortues récurrentes dans l'univers de Mario. Leurs carapaces sont de différentes couleurs (verte, rouge, bleue et jaune), qui symbolisent généralement chacune des caractéristiques différentes. Il existe également des Koopas squelettes, des Koopas fantômes, etc.